戦国時代に入ると忍者の活躍が顕著になっていきます。その代表的なものが、1487年の「鈎の陣（まがりのじん）」です。室町幕府の将軍・足利義尚が近江の大名・六角氏を討伐するために、２万の軍勢を率いて六角氏の居城である観音寺城へと侵攻します。
圧倒的な勢力を前に六角氏は観音寺城を捨て甲賀へ逃げ込みますが、足利軍の追手を退けたのが「甲賀衆」と呼ばれる甲賀の忍者たちでした。六角氏は甲賀郡を含む近江国を支配しており、甲賀衆の多くは六角氏の味方をしました。そのとき六角氏の窮地に駆けつけた甲賀衆を、甲賀五十三家と呼んでいます。